优化凝胶渗透色谱（GPC）性能：使用 BI-MwA 进行多角度静态光散射检测

摘要

凝胶渗透色谱（GPC）与多角度静态光散射（SLS）相结合，是一种先进且强大的用技术，能够无需依赖传统的柱校准即可得到绝对分子量值。GPC-SLS 技术通过定量评估信号强度而不是通过洗脱时间来得到分子量。此外，与聚合物标准校准不同，要准确解读光散射信号，需要知道样品的准确浓度、进样体积及相应质量等信息。

引言

凝胶渗透色谱（GPC）是一种用于测定蛋白质、聚合物和许多其他纳米材料分子量的有用技术。然而，其应用受到必须使用已知分子量（M_w）标准样品对 GPC 柱进行校准的限制，这些标准样品的化学性质可能与未知样品不同。色谱柱的分离机制基于流体动力学和尺寸排阻。在使用不同的洗脱液时，某些样品在洗脱过程中可能会粘附在固定相上，从而导致分子量测量结果不准确。更好的方法是给 GPC 系统配备多角度光散射（MALS）检测器，从而无需柱校准即可准确测量分子量。先通过 GPC 对样品进行分离，然后由而 MALS 检测器测量绝对分子量M_w。

布鲁克海文仪器公司的分子量分析仪（BI-MwA）是一种多角度静态光散射（MALS）检测器，通常与BI-DNDC（示差检测器）一起与 GPC 系统配套使用。通过光纤与内部流动池耦合，可在 7 个固定角度下采集信号，从而实现散射光的角度依赖性测量。使用这种检测器配置进行的典型 GPC 实验会生成包含多达三条曲线的色谱图：紫外（UV）、示差（RI）和光散射（LS）。紫外检测器通常不适合用于检测合成聚合物，因为与蛋白质样品不同，合成聚合物往往只有极小的紫外吸收或无紫外吸收。光散射曲线可以展开，分别显示每个角度的散射光强度。

基础的 GPC 系统由单根色谱柱、进样器、泵和检测器组成，高端 HPLC 系统则可能配备多个检测器、自动进样器、色谱柱恒温箱等更多组件。无论那种情况，GPC 色谱柱本身和检测器都是最重要的组件。布鲁克海文公司的 MwA 能够获取现有 GPC 系统中各类检测器的模拟输出，从而提供额外的检测功能，如粘度、紫外和示差。这些数据可以读入布鲁克海文仪器公司的尺寸排阻色谱采集软件 ParSEC 中，以生成统一的色谱图。通过整合这些数据，既能计算出色谱图中任意一点的瞬时分子量，也能算出预选范围内的平均分子量。

实验设置

分析

对所得数据有三种分析方式，可根据样品的已知信息进行选择。对于未知样品，可能有两个已知参数：进样量和样品的 dn/dc 值。

以下列出三种可能的情况：

结果

我们已经证明了准确测定色谱柱中注入样品浓度的重要性。如下表所示，即使进样体积存在微小差异，表观分子量（M_w）也会发生显著变化。

使用正确进样体积与使用错误设置体积计算的对比

上表示例展示了进样体积变化的影响。数据由布鲁克海文仪器公司的 ParSEC 软件采集，并以三种方式进行分析。分析在已知浓度但未知 dn/dc 值的情况下进行。从分析结果来看，得到的分子量也变化了约 1%，这说明了进样体积变化的影响。

在典型操作中，ParSEC 软件根据 Zimm 方程生成 Zimm 图，并将光散射数据外推至零角度，进而计算出绝对浓度和分子量。由于只有单个浓度的数据，因此无法外推至零浓度。但是，与所有 GPC/SEC 软件一样，ParSEC 软件允许对第二维里系数进行校正。

结论

布鲁克海文公司的 MwA 是一款功能强大的仪器，可以显著提升现有 GPC 系统的性能。可重复的进样量对多角度静态光散射（MALS）与 GPC、SEC 或其他色谱联用技术至关重要。由于浓度是 Zimm 方程（见附录）中的一个关键变量，而 Zimm 方程又是计算分子量的基础，因此这一点十分必要。

• 分析方法的选择。如果进样器的重复性不优于 2%，最好选择已知 dn/dc 值但未知进样量（浓度和进样体积）的分析方法。
• 进样器性能指标。在分析 dn/dc 值未知的样品时（这是最常见的情况），进样器的重复性应优于 1%。这一指标很容易达到。
• 样品浓度性能指标。在分析 dn/dc 值未知的样品时（这是最常见的情况），样品浓度的准确度应优于 1%。这一指标也很容易达到。

附录

光散射计算

在计算分子量时，通常使用 Zimm 方程来分析光散射数据：

Kc/ΔR = 1/M_w (1 + (q² R_g² )/3) + 2 A₂ c

其中，K为德拜常数，是聚合物-溶剂或蛋白质-溶剂体系的一个常数。对于垂直偏振的光，

K = 4 π²n²(dn/dc)²/(N_aλ⁴)

其中n为溶剂折光率，N_a为阿伏伽德罗常数，λ为激光波长。c 为聚合物浓度，在制备样品溶液时精确确定，ΔR 表示溶液的散射光强与纯溶剂散射光强的差值，可通过实验测量。