仪器：
使用 BI-200SM 测量蛋白质样品的分子量
摘要
静态光散射（SLS）能够测量多分散材料以及具有离散聚集数样品（如蛋白质）的平均分子量。合成聚合物本质上是多分散的，非常适合使用这种技术进行直接分析，用平均分子量来更为直观地表示。以牛血清白蛋白（BSA）为例，这种蛋白质有三种异构体（分子量分别为 66.5kDa 、133 kDa 和 200 kDa），此时平均分子量的含义可能就没那么清晰。通过将使用传统静态光散射法在广角光散射系统上测量的分子量与通过尺寸排阻色谱（SEC）实验得到的相对丰度进行比较，可以说明这种关系的性质。
引言
牛血清白蛋白（BSA）是一种易于获取的蛋白质，常被用作更复杂蛋白质或蛋白质药物的替代品。众所周知，在生理 pH 值和离子强度附近，BSA 处于三种具有明确聚集数的异构体（单体、二聚体、三聚体，N agg 分别为 1, 2, 3）的平衡状态。虽然动态光散射（DLS）技术很难解决这些问题，但还是存在一定的可能性。而静态光散射（SLS）由于不具备分辨能力，只能得到一个单一的平均分子量。
结果
这种表达方式（图 1）被称为 Zimm 图 ，它需要进行浓度和角度依赖的光强测量。 Zimm 图 是一种多角度、多浓度的外推法，分别外推至零角度和零浓度。测量的浓度分别为 10 mg/mL、3 mg/mL 和 2 mg/mL，散射角度为 θ = 60°、75°、90°、105° 和 120o。测得的平均分子量约为 81 kDa，这个值对于 BSA 单体（66.5 kDa ）而言太大，但又明显低于二聚体（133 kDa）或三聚体（200 kDa）。为了理解这一点，必须考虑到 BSA 单体与多聚体始终处于平衡状态。
单体 ⇌ 二聚体 ⇌ 三聚体
对于已知材料（在本例中为蛋白质），其折光指数与浓度之间的关系是已知的。如果该物质的折光指数增量（dn/dc）已知，就可以确定其绝对浓度。
dn/dc 是折射率（ns）对浓度作图并外推至零浓度时的斜率。其中，ns 是溶液的折射率。该斜率在很宽的浓度范围内通常呈线性，因此极限斜率往往与稀溶液条件下的斜率相同。
这类似于在已知摩尔消光系数的条件下，通过在 280 nm 处的紫外吸光度测量来确定浓度。在下面所示的色谱实验（图2）中，初始浓度是已知的，因此即使没有任何外部校准，也可以确定每种物质的相对丰度。
微分折光指数（图2）与浓度成正比，因此可以从数量上对各组分（单体和二聚体）的相对含量进行量化。虽然认为存在三聚体，但由于其含量过低，仅通过折光指数无法识别。在知道 BSA 单体和二聚体的相对浓度后，就有可能进一步评估上文单独使用 SLS 测量的结果（图1）。通过对光散射中固有的光强权重的理解，可以根据这些组分的相对含量来估算平均分子量。
请注意，虽然通过示差（RI，图 2）只能识别出二聚体和单体，但 MALS 图谱（图3）能清晰地识别出三聚体、二聚体和单体。在此，三个峰的相对面积随散射角度而变化，其中最大的分子在小角度下的散射最为强烈。这种量化方法用于探究不同权重的影响，并将其与图 1 中得到的分子量进行比较。
平均分子量（MW）通过以下表达式计算得出：
单体 N=1 = 66.5 kDa
二聚体 N=2 = 2×66.5 kDa = 133 kDa
三聚体 N=3 = 3×66.5 kDa = 200 kDa
平均分子量（MW）= ( X% 单体 × 66.5 kDa ) + ( Y% 二聚体 × 133 kDa ) + ( Z% 三聚体 × 200 kDa )
表1 – 基于各组分（N=1、2 和 3）相对丰度预测的平均分子量。
| 平均分子量计算依据 | 单体分子量（kDa） | 单体 | 二聚体 | 三聚体 | 平均分子量（kDa） |
|---|---|---|---|---|---|
| MALS 130 度角下的光强加权 | 66.5 | 80.8% | 13.5% | 5.7% | 83.0 |
| MALS 105 度角下的光强加权 | 66.5 | 80.0% | 13.6% | 6.5% | 84.1 |
| MALS 90 度角下的光强加权 | 66.5 | 78.7% | 13.6% | 7.7% | 85.7 |
| RI 信号的数量加权 | 66.5 | 89.1% | 10.9% | 0.10% | 74.0 |
示差信号能够直接反映给定材料的浓度，而散射光强则是分子量与浓度共同作用的结果。因此，仅基于光强加权的分子量会高估较大分子（特别是二聚体和三聚体）的贡献。回想一下，单独使用 SLS 测得的分子量约为81 kDa，这与表 1 所示基于光强加权得到的分子量结果非常接近。
总结
- 蛋白质中通常有多种具有不同聚集数的组分处于平衡状态（以 BSA 为例，聚集数 N agg分别为1、2、3）。
- 从 Zimm 图获得的任何分子量都是这三种异构体的平均值。
- 当与色谱分离方法（在本案例中为 GPC）联用时，折光指数可用于测量不同分子量组分的相对丰度。
- 使用以下两种方法计算平均分子量相对简单：（i）光强加权；（ii）数量加权。
结论
静态光散射可用于测量多分散样品（包括蛋白质）的分子量。生物样品通常具有明确的聚集数（单体、二聚体等）。在平衡控制的自缔合情况下（如蛋白质二聚化），各组分非常明确，因此分子量将是彼此的整数倍。本文探讨了多组分体系中静态光强、分子量和相对浓度之间的关系。
参考文献
- Zimm, Bruno H., “Apparatus and Methods for Measurement and Interpretation of the Angular Variation of Light Scattering”, J. Chem. 16, 1099 (1948).
- J. C. Moore, “Gel permeation chromatography. I. A new method for molecular weight distribution of high polymers”, J. Polym. Sci., A-2, 835 (1964).
- Weiner, Bruce B., “Let There Be Light: Characterizing Physical Properties of Colloids, Nanoparticles & Proteins Using Light Scattering”, Amazon, (2019).