使用 BI-ZTU 进行 pH 自动滴定

摘要

纳米材料分散的稳定性通常取决于其较高的表面电荷。这些电荷往往与 pH 值相关，特别是对于表面带有酸性或碱性官能团的化学物质。可通过滴定快速分析一系列溶液，以确定稳定性如何随配方的 pH 值变化。这对含有蛋白质的配方尤为有用，因为其中的成分通常包含带正电和负电的侧链混合物。

引言

布鲁克海文仪器公司的自动滴定仪（BI-ZTU）为研究人员提供了一种研究 pH 值对 Zeta 电位（ζ）影响的工具。ZTU 是一款配件，与 NanoBrook 系列仪器配套使用，可自动测量合成和生物来源的纳米材料（如蛋白质、树状大分子、生物大分子和纳米颗粒）的等电点。ZTU 使用多个计量泵来抽取不同浓度的酸、碱以及可能的其他滴定剂。该滴定仪可直接与 NanoBrook 连接，用于 Zeta 电位（ζ）和粒径（d_h）测量实验。该系统可以设置为在用户定义的 pH 值范围内进行滴定，或进行添加剂滴定，并生成粒径或 Zeta 电位随 pH 值或添加剂浓度变化的数据。在以下示例中，我们将讨论其对 Zeta 电位的影响。

许多商业化的纳米材料会在其表面电荷或 Zeta 电位显著降低的条件下发生聚集。pH 值是控制表面电荷的一个明确变量，它会导致各种表面基团的电离度（α）发生变化。

可滴定侧链通常分为两大类：酸性和碱性。酸性侧链通常具有较低的 pk_a值，并在 pH>pk_a 时带电。相比之下，碱性侧链在 pH<pk_a 时带电，而在高 pH 时不带电。在 pH 滴定中，我们通常只考虑在 pH 值 2- 12 之间可滴定的质子；因此，在仅考虑羧酸和胺的简单情况下，从低 pH 值到高pH 值的相关转变是 R-CO₂H 到 R-CO₂^-1，以及 R-NH₃⁺¹ 到 R-NH₂。

如图1所示，碱性侧链的电离度在低 pH 值时为1，此时胺带正电（Z = +1），而在高 pH 值时质子被移除，电离度为0。酸性侧链则相反，它们在低 pH 值质子化时呈中性，此时 Z = 0，而在高 pH 值去质子化时带电，此时 Z = -1。

为了理解这对含有酸性和碱性基团混合物的样品（这在蛋白质和其他生物样品很常见）有何影响，我们需要关注净电荷（Z^net），而非单个侧链电荷。下面以简化情形为例进行说明，即每种类型仅存在一个侧链（图 2）。

合成纳米颗粒通常具有单一的主导表面化学性质，这意味着这些颗粒在不同 pH 条件下要么带电，要么不带电，其电荷的正负由表面化学性质决定。而生物来源的材料，如蛋白质或其他生物大分子，通常含有酸性和碱性的混合基团。pH 滴定可以作为一种有效的方法，通过实验测定未知材料的等电点。

如下文所示，pH 依赖性将取决于表面化学性质；对蛋白质而言，常见的可滴定基团是各种氨基酸的侧链。常见的酸性氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸，它们都含有羧基侧链，而碱性氨基酸如组氨酸、赖氨酸和精氨酸则含有胺基侧链。

结果

一种主要成分基于蛋白质的商业配方在低 pH 值条件下制备而成，随后使用自动滴定仪测量了Zeta 电位随 pH 值的变化（图1）。滴定曲线与零线相交的点可用于估算等电点，因为当净电荷为零时，Zeta 电位也为零或接近零。

如图3所示，ZTU 可用于含蛋白质配方 Zeta 电位的自动滴定。从低 pH 值开始，此时我们认为必然存在过量的带正电基团，导致 Zeta 电位为正值（接近ζ = +25 mV）。当 pH 值接近中性时，带负电和带正电的侧链数量大致相等，净表面电荷降至接近零。随着 pH 值的进一步升高，碱性残基的电荷最终消失，仅留下酸性或带负电的基团贡献表面电荷，在 pH 值接近 12 时 Zeta 电位达到极限负值（ζ = -40 mV）。通过该滴定实验我们可以得出结论：该蛋白质的等电点位于 pH 值 6 附近，此时 ζ 趋近于 0 mV；当 pH 值低于 4 和高于 9 时，Zeta 电位足够高，足以防止聚集。此外，在碱性 pH 值条件下测得的 Zeta 电位极值高于酸性 pH 值下，这表明该样品中带负电的氨基酸多于带正电的基团。

总结

• 自动滴定仪可用于在较宽 pH 值范围内测定蛋白质的稳定性。
• 对于含有酸性和碱性侧链混合基团的材料，零（净）电荷点通常对应于两种基团均会被电离的 pH 范围。
• 研究 Zeta 电位随 pH 值的变化使我们可以通过实验确定等电点。